חוקרים מאוניברסיטת קליפורניה סאן דייגו חשפו כי אנזים חיידקי מרכזי בביטוי גנים מסוגל לקרוא בדיוק רב אלפבית גנטי שמכיל שמונה אותיות, במקום ארבע שהן השגרה בכל יצור חיים על פני כדור הארץ. מה שנתגלה פורסם ב-Nature Communications ב-2 בספטמבר, והמחקר הובל על ידי דונג וואנג מבי"ס הרוקחות והמדעים הפרמקולוגיים של UC סאן דייגו. במחקר הם שילבו בדיקות תעתוק עם ארבעה מבני מיקרוסקופיה אלקטרונית קרים (cry-electron microscopy) ברזולוציות בין 2.42 ל-2.75 אנגסטרם, על מנת להבין כיצד RNA פולימראז מתמודד עם זוגות בסיס מלאכותיים.
מהו אלפבית Hachimoji ומה משמעותו בלב המחקר?
האלפבית הנבדק נקרא Hachimoji, חלק מהמערכת שהוגדרתה כ-"מערכת מידע גנטי מופשטת ומוגדלת באופן מלאכותי". כפי שהודיעה אוניברסיטת קליפורניה סאן דייגו, שיטה זו מוסיפה לזוגות הסטנדרטיים של A, T, G ו-C שני זוגות מתוכנתים: P עם Z, ו-B עם S. המחברים מציינים כי תוצאות המחקר מראות כי האנזים יכול לזהות בזוגות המלאכותיים את ההיררכיה הפנימית של זוויות לוויתן־קריקון (Watson-Crick), ולהפעיל את הלולאה האחראית על הפעלת האנזים, בדומה לאופן שבו האנזים עובד עם זוגות הטבעיים.
חשיבות הדיוק וההבדל בין יצירת זוג בסיס לבין קריאת גן בתוך תא חיים
עיצוב זוגות בסיס מלאכותיים אינו חדש. כימאים מייצרים זוגות כאלה מאז סוף שנות ה-80, ומערכת Hachimoji תוארה לראשונה בכתב העת Science ב-2019. מחקרים מוקדמים הראו כי זוגות אלה מתקבלים בברכה על ידי DNA polymerase מסוג Taq בעת שכפול ו־RNA polymerase של T7, אנזים פשוט שהושאל בקרב חיידקים ווירוסים.
מה שהופך את המחקר לייחודי הוא ההבנה האם המערכת המורכבת יותר, שמבצעת את תהליך ההורשה בתוך חיים בתאים, תתאים גם היא לשימוש בזוגות בסיס מלאכותיים. מכשיר זה כולל בקרות איכות שבודקות בדיוק את תהליך הקריאה. בלולאת הטריגר, חלבון גמיש שנמצא באלזור המנגנון, מתקפל באופן יאוש כאשר זוג בסיס תקין נטען, וזו שיטה להימנע משגיאות תעתיק. מחקר קודם שלהם, שפרסמו בשנת 2023, חקר את מבנה בסיסי מערכת עם שישה אותיות, ובו זוגות B ו-S, אך זוגות P ו-Z הושארו עד כה בלתי מנותחים בתנאי תאים חיים.
המחקר החדש ענה על שאלה זו באופן מובהק. שתיים מתוך זוגות הבסיס המלאכותיים – P עם Z – עיקבו אחר ההיררכיה המוכרת של זוויות לוויתן־קריקון במרכז פעולת האנזים, וגרמו לסגירה של לולאת הטריגר, תוך שמירה על מיקומי שאר חומצות האמינו במבנה כמעט זהה לאלו שמזוהים עם זוגות הטבעיים. בדיקות מדידות הראו כי קצב ההכללה של זוגות אלה היה בערך שני שליש מקצב הזוגות הטבעיים, ומבחני המשך הראו שהאנזים המשיך לכתוב על המקטעים המלאכותיים בנורמה, בלי לעצור וללא שגיאות מיוחדות.
תופעה שלילית, נושאי תיקון והגילוי של Z*
מחקר יוצא דופן בפקחותו מדבר גם על חסרון עיקרי. זוג Z נושא קבוצת ניטרו (nitro group) הפוגעת בחומציותו ומרמזת על פוטנציאל לבעיות. קבוצת ניטרו מפחיתה את ערך ה-pKa של הבסיס לכ-7.8, מה שמסביר שכאשר מדובר בסביבה חומצת פנימית של תא, Z עלול לאבד פרוטון ולהמיר את עצמו במבנה שמזכיר מאוד את ציטוזין ויכול להיקשר ל-G. החוקרים זיהו בדיוק את ההתרחשות הזו: מקרים של חיבורים שגויים של G ל-Z היו בולטים מעל כל זיווג בלתי מתאים אחר, והמחקר מציין כי תופעה זו תועדה גם בעת שכפול DNA, מה שמצביע על חולשה כימית, ולא על פגם יחיד במערכת.
כדי לטפל בבעיה, פיתחו החוקרים שיטה כימית. הם החליפו את קבוצת הניטרו בקבוצה קרבוקסמידית (carboxamide), שהעלתה את ערך ה-pKa ליותר מ-10, וכך נמנעה יותר המלחמה של פרוטון, ובכך שיפרו את האמינות של הזוג. ההחלפה נקראה Z והסבה ירידה משמעותית בשגיאות, אך למרות זאת, Z התקדם לאט יותר. השוואת תוצאות המחקר הראתה שהקבוצה הניטרו יותר יציבה מתאימה את המבנה של חומצה יחסותית שמקשרת עם תעלת המים (water-mediated interaction) בברידג' הייליקס של האנזים, שתורמת לסגירת לולאת הטריגר. בלי הקבוצה הזו, המבנה נשאר במצב פתוח ופחות פעיל קוליטית.
החוקרים אינם משבחים את התיקון באופן מופרז. הם מגדירים את Z* כשלב ראשוני לקראת זוג מלאכותי אופטימלי יותר ומבקשים כי שיפורים נוספים יובילו ליעילות רבה יותר. כמו כן, הם מדגישים כי בדיקות התעתוק הממוקדות בטעות נעשו במבחן חד-ניטורני, בו הוגשה חומצה אחת בלבד בכל פעם, ולכן שיעורי הטעות שהם מצאו עלולים להיות מְוגזמים ביחס למה שיקרה במערכת שלמה שבה הדיוק תחרותי עם חומצה נכונה.
נסיונות בנפרד בתנאי מעבדה, לא בחיים
ההבחנה החשובה למחקר ולסביבת המחקר היא בין ניסוי במבחנה לבין חיים אמיתיים. מדובר במחקר המבנה של תהליך תעתוק במעבדה, תוך שימוש באנזים טהור שהופק מתבניות ביטוי, מולקולות קצרות של דנ"א ורנ"א שהוזמנו מספק מסחרי, ובסינתזות של נוקלאוטידים שהומחשו על ידי חברה מפלורידה. לא שחררו חיידקים שלא תכננו או הקימו אורגניזמים עם זני חומצות בסיס מלאכותיות. אין בדיקה של סיכון אקולוגי או סיכוני סביבה.
מידע מסקירת שיטות המחקר ראוי לציון. ארבע אותיות המערכת המלאכותית אינן קיימות בטבע, והן הוכנו באמצעות סינתזה כימית ומסופקות בשנית באמצעות תחליפים של Phosphoramidites וריבוטריפוספטים מרפובליקה פלורידאית. כל חיידק או יצור שמותאם לשימוש בזוגות בסיס אלה יחויב לייבא את הייצור המלאכותי, וזה מגבלה שיש לה תוצאות שחשוב להכיר.
חשוב גם לציין שהמחקר לא עוסק בהשפעה על סוגי תאים אחרים, כמו תאוחי אדם או צמחים, ולכן אין מחקר שמזהה כיצד מערכות תעתוק בטבע יגיבו לזוגות המלאכותיים האלה.
מידע, שקיפות ומי שעוקב אחריו
המידע והנתונים שפורסמו זמינים לציבור. נתוני Cryo-EM נאספו במרכז Cryo-EM שבסטנפורד, בתמיכה של המכון הלאומי למדעי הרפואה הכלליים, והמחברים הצהירו כי אין להם היבטים מסחריים מתחרים. בנפרד, סטן בלנר, שותף חשוב בפיתוח מערכת Hachimoji, עוסק בשני מחברי-שותף במוסד Foundation for Applied Molecular Evolution באלאצ'ה, פלורידה, ובאותה עיר גם החברה שסיפקה את הנוקלאוטידים המלאכותיים. כל המבנים והמידע הוכנסו לבסיסי הנתונים של Protein Data Bank ו-Electron Microscopy Data Bank, והמאמר זמין בחינם לקהל הרחב, כדי לאפשר בדיקה ואימות על ידי קבוצות אחרות.
מחקר משותף אחר מאותה קבוצה פורסם לאחרונה ב-Proceedings of the National Academy of Sciences, והודיע כי RNA פולימראז מסוגל גם לזהות זוגות בסיס מלאכותיים אחרים, שאינם מחוממים את הקשרים המימיים הנחשבים חיוניים לזוגות הבסיס של ה-DNA.
מה שהמחקר מציע הוא כיוון עתידי – פיתוח תרגום ל-mRNA והפקת חלבונים, למרות שהשגת מערכת שמכילה שמונה אותיות ולא משפיעה ישירות על חיי היום-יום, וכן פיתוח RNA שאינו מתפקד כקוד, אך יכול לקשור תיקנים חזקים יותר, למשל, באמצעות Aptamers עם שישה אותיות שהוכנסו לדנ"א ושמשמשים כבר לדחוס תרופות לתאים, כדוגמת ה-deliver למגנון הלב.
המסקנה המינימלית וההגיונית היא שאנזים בתא רגיל מצליח לקרוא אותיות גנטיות מתוחכמות שמייצגות אלפבית מלאכותי, באותה מופה שבה הוא פועל עם הטבעי, וכך מצמצם מחסום אחד בין זוגות בסיס מלאכותיים לתפקוד בתוך תא. זה לא מעמיד כל יצור שמבוסס על שמונה אותיות כנוכחי, או מחריד מיידי, או מעלה חששות סביבתיים נוכחיים. המטרות הבאות הן לבדוק אם אפשר ליישם זאת יותר בביולוגיה חיה, ולשפר את זוג ה-Z, שאף הם עדיין בשלבי פיתוח.
